光学顕微鏡

図：クリスタルガラスの顕微鏡の小さな置物。こんなのを作るところを見るとヨーロッパでは顕微鏡が生活にも入り込んだ道具なのかなぁと思っていたら、廃盤になるらしい…。

顕微鏡小史
顕微鏡の光学系明視の距離単式顕微鏡複式顕微鏡有限光学系と無限光学系対物レンズ対物レンズの倍率開口数と分解能作動距離（作業距離）カバーグラス厚さと球面収差用途別の分類接眼レンズ照明光学系構成要素	顕微鏡のセットアップ光源とコンデンサの調整光源内蔵顕微鏡の調整ケラー照明の調整偏光顕微鏡の対物芯だし
いろいろな顕微鏡	顕微鏡の清掃・簡単な修理

顕微鏡小史

　顕微鏡は物体を拡大して観察するための機器である。１７世紀の初めの顕微鏡の発明以来、ほんの数十年前までの300年の間、「顕微鏡」は光学顕微鏡のことを指し示す言葉であった。しかし、２０世紀中頃に電子顕微鏡が発明され、後半には走査プローブ顕微鏡などが発明され顕微鏡の概念も拡張している。また、光学顕微鏡にしても共焦点レーザー顕微鏡やビデオシステムの活用など古典的な光学顕微鏡からの技術的な進展もある。しかし、ここでは、古典的な光学顕微鏡に限って話をすすめる。

　人類がいつの時代に凸レンズの拡大作用に気がついたのかは明らかにはされていない。レンズを用いたもっとも簡単な光学機器の一つである眼鏡の出現は13世紀後半にまで遡るので、その時代には凸レンズによる拡大鏡も世間に知られるようになっていたと推測される。凸レンズが虫眼鏡のレベルから顕微鏡と呼べるものになったのは記録に残る限りで16世紀の終りから17世紀の初めごろである。顕微鏡のうち、１組のレンズのみで拡大を行なうものを「単式顕微鏡」、対物レンズと接眼レンズで２段階の拡大を行なうものを「複式顕微鏡」という。複式顕微鏡の方が操作性がよく、今日では研究の現場において単式顕微鏡を見かけることはない。しかし、顕微鏡が発明されたと言われる１７世紀初頭においては、高性能レンズを作製する前提となる結像理論もなく、また、色消しレンズを作製するのに必要な各種のガラス素材もなかったため、複式顕微鏡の性能は単式顕微鏡よりは低いものであった。研究の第一線では当然単式顕微鏡も用いられていた。

　１７世紀になると顕微鏡を用いた観察記録が出版されている。1625年にフランセスコ・ステルーティによる「ミツバチの図」という書籍が発行され、1665年にはロバート・フックにより有名な「ミクログラフィア」が出版された。フックは最大倍率が50倍程度の複式顕微鏡を用いて、コルクや蚤といった日常的な物体を観察し、その精緻な図版をミクログラフィアで公表した。「ミクログラフィア」という名称からは顕微鏡図譜という印象を受けるが、実際には顕微鏡とは関係のない様々な科学的論考も含んだ書籍であり、ビジュアルな科学読み物の元祖とでもいうべきものかもしれない。フックの本は当時の物好きな上層階級の間に大きな影響を与えた。この時期から第２次大戦前にかけてのヨーロッパにおいては科学は上層階級の趣味として認知されており、それは、現在においても科学に対する社会の理解という点で影響を残しているようにも思える。

　フックの本に影響を受けたと思われる人間の中にオランダのレーウェンフックがいる。彼は商人の出であったが、科学的なことにも興味を持ち、光学性能が優れた単式顕微鏡を用いて多く非日常的な物を観察した。彼は微生物を発見し、細菌を観察し、精子を発見し、木材の組織についても実験を行なっている。精力的な観察の一方でレーウェンフックは生涯に 500を超える単式顕微鏡を作製したと言われている。その中で９つほどの顕微鏡が現存しており、倍率266倍、分解能1.4 μｍというきわめて高い性能を示すものもある。彼の観察及び発見は多岐に及び、その成果は英国王立学会へレターで報告された。この記録は100 年以上も科学的な価値を保っており、19世紀の生物学者の間でも新発見を主張する前にレーウェンフックのレターを確認しておく必要があると言われていた。単式顕微鏡はレーウェンフックの後も発達を続け、多様な機種を産み出した。分類学で有名なカール・リンネウスやブラウン運動を詳細に報告したロバート・ブラウンも単式顕微鏡の使い手である。単式顕微鏡の中には500倍近い倍率のものまで存在していた。当時の単式顕微鏡の中には現在の解剖顕微鏡と似た形態のものもあるが、低倍率の解剖顕微鏡とは全くことなる高倍率の顕微鏡であった。

　複式顕微鏡は18世紀の色消しレンズの発明などを通して徐々に進歩していった。顕微鏡とほぼ同時期に発明されたと言われている望遠鏡は軍事技術として重視され、その性能向上のために1900年ごろまでにはヨーロッパのいくつかの国でクラウンガラス・フリントガラスとも安定して生産されるようになりそれを利用した本格的な色消しレンズが作られるようになった。19世紀前半には職業としての顕微鏡作製者がヨーロッパ諸国には存在し、光学系に対してもいろいろな改良が加えられていった。例えば、イタリアのアミチにより、半球状に近い初段のレンズや油浸技術が開発され、イギリスのリスターにより２組の色消しレンズを用いて色収差のみでなく球面収差も低減した対物レンズの概念などが開発された。これらの顕微鏡製作所の一つとして1846年には後に顕微鏡の歴史に大きな足跡を残すカール・ツァイスが製作所を起こしている。しかし、この時代にはレンズの設計原理は確立しておらず、職人が勘と経験で作製した対物レンズの中で優れた性能を示した品物のコピーを作って製品としていた。製作所の設立から、しばらく後にはツァイスの複式顕微鏡は高性能と認められていたが、それでも性能的にレーウェンフックの単式顕微鏡の最高性能の物には及んでいなかった可能性が高い。

　複式顕微鏡の性能を画期的に向上させたのがイエナ大学の講師であったアッベである。彼はツァイスからの依頼を受けて1866年からツァイスの光学製作所の指導を始めた。アッベが最初に行なったのは製造工程の変革であった。それまでの顕微鏡の対物レンズの最終仕上げは、ばらつきのあるレンズで組み上がった対物レンズを職工長が経験に基づいて調整して製品としていた。顕微鏡の性能は職工長の腕に大きく依存していたのである。アッベは各々のレンズの寸法や許容値を設定し、職工長による調整なしに対物レンズを組み上げられるようにした。このシステムの完成により光学的な原理に基づいて設計したレンズをきちんと製作する体制が整った。次の段階としてアッベは彼の光学理論に基づいて対物レンズの設計を行った。それまで、経験的に見込み角（NA)の大きな対物レンズの方が分解能が高いことが知られていた。しかし、アッベは見込み角より収差補正を重視し、見込み角は小さいが球面収差の補正が行われたレンズを設計した。ところが、アッベが設計したレンズは解像力が低く、それまで職工が経験的に製作したレンズよりも性能が低い品であった。そこで、アッベはNAが大きく、また球面収差を補正したレンズを設計した。このレンズは中心部の解像度は高かったが中止から少しでもはずれると収差のため像の質が大きく劣化し実用的な品ではなかった。これらの失敗からアッベは顕微鏡の結像理論を研究し見込み角と分解能の関係を明らかにした。また、収差を補正するための条件も（アッベの正弦条件）導き出し、その成果をもとに新しい対物レンズを設計した。このレンズはきわめて良好な性能を示した。さらに1870年代の後半にはツアイス社からきちんと設計された油浸レンズが提供され、、ここにようやく分解能において単式顕微鏡を確実に超える複式顕微鏡が確立した。この顕微鏡は、早速コッホによる結核菌・コレラ病原体の発見に威力を発揮した。

　アッベは収差を補正したレンズを作製するのには種々の光学ガラスが必要であることを認識していた。そこで、化学者のショットが新種ガラスを開発するのに助力した。また、必要とする光学的性能のガラスが得られない場合には天然の蛍石を用いるなど、材料の選択にも努力を払っている。　アッベの努力によりカール・ツァイス社は顕微鏡・光学機器メーカーとして世界的な地位を築きあげた。その後も、いちはやくケラー照明を実用化するなど先進的な技術を保ち続けた。ツァイス社は第二次世界大戦後の東西ドイツ分割により大きなダメージを受けたものの現在も１流の光学機器メーカーとして、その地位を保っている。

図：ツアイス社の顕微鏡。戦前の同社のカタログより

　日本では明治以降の工業社会が発展する過程で、多くの顕微鏡メーカーが存在していた。例えば、千代田・エリザ・金栄・高千穂・八州・スンプ・マグナ・島津・協和といったブランドの顕微鏡があったが、これらのメーカーは顕微鏡製作をやめたり他のメーカーに吸収されたりしてしまった。ネットオークションなどで、これらのメーカーの顕微鏡が出品されることはあるが現在では、我が国の総合研究用顕微鏡メーカーは実質的にオリンパスとニコンの２社となっている。輸入されている外国製品は上記のツァイス社の他にライツ社があり、国内で用いられている研究用顕微鏡は、これらの会社の製品が中心である。もちろん、現在でも国内に上記２社以外にもいくつかの顕微鏡メーカーがある。家庭用として、カートン、ビクセン、ミザール、ケンコーなどの望遠鏡や写真用品を作っている会社の顕微鏡を目にすることも多い。教育用としては、これらのメーカーの他にヒトミ光機があり、研究・工業用では、埼玉に本社を置くメイジテクノ（この会社は米国への輸出を中心としており国内ではほとんど知られていない）や、ユニオン光学、ミツトヨ（測定器メーカーだが長作動距離の特徴あるレンズを揃えている）、DAIKO（携帯用顕微鏡を出している）などがある。これら以外に研究用のビデオ顕微鏡や共焦点顕微鏡など特殊な製品を中心としているメーカーもある。

　国外のメーカーとして、独逸のライツ社とツァイス社が優れた顕微鏡を提供している。かつては米国ボシュロム社も研究用顕微鏡を製造していたが現在では顕微鏡市場から撤退している。顕微鏡の部品では、赤外領域での顕微分光測定に欠かせない反射対物レンズのメーカーなど、特色ある製品も見られる。

顕微鏡の光学系

明視の距離

　顕微鏡の光学系を議論する前に、目で物を見ることについての復習をしておこう。人間の目は無限遠方を見ているときに、空気中で焦点距離が17mmのレンズとして扱うことができる。物体が有限距離にある場合には、ピントが合わなくなるのでピント調整の必要がある。カメラレンズの場合にはピント調整はレンズを繰り出してレンズと焦点面の距離を変えて行う。しかし、人間の目の場合にはレンズから網膜までの距離は変化しないので、その代わりにレンズの焦点距離を変化させて焦点調節を行う。同じ物体でも遠くにあるよりは近くにある方が細部まで詳細に観察できる。確かに、同じ物体でも目に近づけると見込み角が大きくなり、網膜上の像も大きくなるわけである。

　カメラレンズの繰り出し量に制限があり、近すぎる物体にはピントが合わないのと同様に、目のレンズの焦点調整範囲にも限界があり、目に近すぎる物体には焦点を合わせることができない。どこまで近くの物まで見られるかについては個人差がある。例えば、近視の人は遠方にピントが合わない代わりに、より目に近い範囲までピントがあうし、遠視の弱視の場合にはその逆になる。また、年齢による系統的な変化もあり、４０をすぎてしばらくすると「はなせばわかる４０代」となり近くの物にはピントが合わなくなり、老眼鏡のご厄介になるようになっていく。こうした個人差はあるものの、それをいちいち考慮していては、一般的な議論を進めることができないので、目から25cmをピントの合わせられる最短距離として定義してこれを明視の距離と呼ぶ。英語では明視の距離のことを“　”と呼ぶ。この英語を日本語に忠実に訳せば「はっきり見ることのできる最近接距離」となる。この距離で物を見たときの大きさがルーペ等の拡大倍率の基準となる。

単式顕微鏡

　単式顕微鏡は倍率こそ虫眼鏡（ルーペ）より高倍率であるが、光学的には等価で物体の拡大された虚像を観察する。ルーペの倍率は、目とルーペと物体との配置により変化する。しかし、それでは倍率を一意的に定義できないので、物体をレンズの焦点の位置に正確においた場合を基準とし、その時の拡大率をルーペや単式顕微鏡、さらには接眼レンズの倍率として定義している。

　図に、明視の距離で物をみる場合の網膜上の像の大きさと焦点距離ｆのレンズの焦点位置に物を置いた場合の網膜上の像の大きさを示した。

目のレンズから網膜までの距離を17mmとすると明視の距離においた高さaの物体の網膜上の像の大きさは17a/250となる。一方、焦点距離fのレンズを目の前に置いて、その焦点に高さaの物体を置くと、物体のある点を出た光はレンズを通過した後に平行光線となり目に入る。この時の網膜上での物体像の大きさは17a/fである。明視の距離で見た場合に対して、250/f倍の大きさになる。この時、目は無限遠方を見ている。レンズと目の間の距離が変わってもレンズの拡大倍率に変化はない。しかし、目からレンズを離すと一度に観察できる範囲が狭くなる。これは、中止から離れた所からの光線はレンズ通過後にレンズと目の軸に対してある角度を有しており、そのため、レンズと目の距離が離れると瞳孔に入らなくなるためである。ルーペはなるべく目に近づけて使う方がよい。特に倍率の高い、焦点距離の短いレンズの場合には中心かららずれた部位からの光のレンズ通過後の傾きが大きくなるのでレンズを目に近づけないと観察する領域はきわめて狭くなってしまう。

　上の関係式よりは、レンズの焦点距離が250mm以上だと明視の距離で物を見た場合よりも物が小さく見えることになる。これは、焦点距離が250mm以上のレンズの場合には明視の距離よりも遠いところに物が置かれることになるためである。しかし、実際には焦点距離が250mm以上のレンズを通して物を見ても、物は大きく見える。これは、目には焦点調整機能があるためである。目の焦点調整能力により有限距離の物を見るようにすると、物体の位置ははよりレンズに近づき、その結果、網膜上の像の大きさもより大きくなる。目の焦点機能を最大に発揮して明視の距離に焦点を合わせた状態では、網膜上の像は250/f+1倍になることが知られている。

　レーウェンフックの266倍の顕微鏡レンズの焦点距離は上の関係式より計算すると約0.94mmであり、屈折率が1.5程度のガラスを使った球形レンズでこの焦点距離のものの大きさは直径約1.3mmとなる。実際のレーウェンフックの高倍率の単式顕微鏡もきわめて小さなレンズを使っており、このレンズをのぞき込むため操作性は必ずしもよくはないようである。

複式顕微鏡

　現在の顕微鏡は複式構成で、対物レンズで拡大された物体の像（実像）を接眼レンズでさらに拡大して観測する形態になっている。顕微鏡の総合倍率は対物レンズの拡大倍率に接眼レンズの拡大倍率を掛け合わせたものになる。

図：複式顕微鏡の光学系（有限光学系）。物体の実像が対物レンズにより接眼レンズの前に空中像として形成される。接眼レンズは、対物レンズによる像の虚像を目に送り込む働きをする。対物レンズで物体像が反転するが、接眼レンズでは反転しない。このため、顕微鏡の画像は反転して見える。（単式顕微鏡は実像を一切形成せず、対物レンズによる虚像を観察するので反転しない像が観察される。）

　複式顕微鏡において、物体の異なる場所からでた平行な光束が対物レンズを通過後に収束する位置を対物レンズ後焦点面という。偏光顕微鏡のコノスコープ画像は、この位置画像を観察している。その時にはベルトランレンズと呼ばれるレンズを鏡筒内に設置して、対物レンズ後焦点面の像を物体空中像の位置に結ばせるようにする。通常の顕微鏡にはベルトランレンズが入っていないため接眼レンズをつけた状態で対物レンズ後焦点面の画像を観察できないが、接眼レンズを外して直接鏡筒をのぞき込めば、この位置での画像を直接目視により観察することができる。

有限光学系（有限補正光学系）と無限光学系（無限補正光学系）

　複式顕微鏡には有限補正光学系のものと無限補正光学系のものがある。有限光学系では対物レンズは単体で試料の像を形成する。それに対して無限光学系では対物レンズ単体では試料の１点からの光線を平行にするのみで特定の位置に試料の像を結ばせることはしない。鏡筒内部に結像レンズを置き、これにより対物レンズからの光束を集光して像を形成する。

図：有限補正光学系と無限補正光学系。有限系では対物レンズ通過後の光は結像位置めがけて収束する光束となる。一方、無限系では対物レンズを通過後の光は平行光束となりそのままでは画像を結ばない。

　有限系においても、無限系においても対物レンズがある焦点距離をもった凸レンズであることに変わりはない。実際、無限系の対物レンズを有限系の顕微鏡につけたり、その逆をやったりして像を観察することができる。しかし、このような使用は特に高NAの対物レンズでは望ましいことではない。収差により画像の質が低下するからである。

図：半球レンズの球面収差（左）とコマ収差（右）

　図に半球のBK7のレンズに左側から平行光線を入射した場合の図を示した。平行光線は１点で収束せずにレンズの外周部を通った光ほどレンズの近い部分で収束しているのが分かる。球面から構成される単レンズでは常にこのように平行光束は１点に収束せずに広がりを持ってしまう。これを球面収差という。球面収差があると像のシャープさが失われて細かい部分が見えなくなってしまう。光軸に対して傾いた平行光線が入射する場合も、光は一点で収束しない。これをコマ収差という。コマ収差があると周辺部の画像の質が劣化する。単レンズでは球面収差とコマ収差を無くすことは不可能だが、複数のレンズを組み合わせることによりこれらの収差を低減できる。顕微鏡の対物レンズでは、少なくとも球面収差とコマ収差の補正を行っている。

図：半球レンズの場合の入射方向による収差の違い

　球面収差やコマ収差の発生量は入射光の状態により変化する。その一つの例として半球レンズの凸側と平面側から平行光束を入れた場合の集光の様子を示した。凸側から平行光線を入れた方が、平面側から入れた場合に比べてはるかに光がよく収束しているのが分かる。写真レンズなどの、ある距範囲の画像を結像する必要があるレンズの場合には必要とされる領域で実用的な画像が得られるように収差の補正が行われている。それに対して顕微鏡の対物レンズでは、ある特定の距離でのみ収差の補正が行わていればよい。そして、その方が広範囲に渡る収差補正を試みるよりは、特定の距離における補正が高度に行える。このため、顕微鏡の対物レンズでは、特定の焦点位置を想定して、その位置に最適化した補正を行っている。逆に言えば、レンズの設計条件以外では収差の補正は行われておらず、画像の質は低下する。これが、無限系レンズを有限系顕微鏡に取り付けても画像は見られるが、そのような使用を勧められない理由である。球面収差やコマ収差は見込み角（ＮＡ；定義は後述）が大きくなると大きくなるので、画像の低下は倍率が高い（必然的にNAも高い）レンズで大きくなる。　　

　複式顕微鏡が出現した時から、２０世紀の中頃までは複式顕微鏡は有限光学系を用いていた。しかし、後半から無限系への移行が起こり、現在では世界の主要な研究用光学顕微鏡メーカーの製品は無限光学系になっている。有限光学系では、対物レンズの取り付け位置から接眼レンズまでの距離に自由度がないのに対し、無限光学系では対物レンズから結像レンズまでの間隔に自由度がある。このため、反射照明系や偏光素子などの種々の光学部品を組み込んでも鏡筒長の変化による画像変化は少ない。ただし、無限系光学系だからといって、鏡筒長を任意に延ばせるわけではない。試料面の光軸からはずれた点から発する光は対物レンズを通過した後に、光軸に対して有限の角度をもった平行光線となる。このため、対物レンズと結像レンズの間があきすぎると、光束が結像レンズに入らなくなる。光束の傾きは光軸から離れた点ほど大きくなる。それ故に、無限系システムで対物レンズと結像レンズの間を離しすぎると視野が狭くなる。また、結像レンズに入る場合でも結像レンズの周辺部を使うことになり、結像レンズの性能が十分でないと収差が発生することになる。一般にはコストとの関係か結像レンズは必ずしも凝った光学系にはなっておらず、それ故に周辺部では性能が低下する懸念がある。

　なお、無限系の対物レンズの中には結像レンズとの組み合わせにより像面湾曲補正を行うタイプと、対物レンズ単体で像面湾曲補正が行われており、収差のない結像レンズと組み合わせて用いるものがある。対物、結像レンズとも収差がない方が使い勝手はよい。特に、結像レンズに他のレンズを用いることを考えている場合には収差補正が行われた対物レンズを選ぶ必要がある。最新の無限補正系対物レンズは単独で収差が補正されているタイプになっているので、迷うときには新しいものを購入すれば問題はない。

　対物レンズの取り付け位置から接眼レンズの取り付け位置までの距離を機械的筒長と呼ぶ。有限系光学系で対物レンズ取り付け位置から対物レンズの結像面までの距離を対物レンズ像距離と呼ぶ。また、接眼レンズ取り付け基準面から、対物レンズ像面までの距離を接眼レンズ同焦点距離という。JISでは接眼レンズ同焦点距離は10mmに指定されている。対物レンズの像距離と接眼レンズの同焦点距離の和は機械的筒長に等しくなる。対物レンズの後側焦点から接眼レンズの前側焦点までの距離を光学的筒長と呼ぶ。対物レンズにより後側主点の位置は異なるので、光学的筒長は装着する対物レンズにより異なる。一方、無限光学系には対物レンズ像距離という概念はないが、それに替わるものとして、結像レンズによる像面位置がある。

対物レンズ

　対物レンズこそが顕微鏡の性能を決める最も重要な部品である。顕微鏡開発史の中心的なテーマは、いかに諸収差のない開口数の高い対物レンズを作成するかであった。今日ではいろいろな用途向けに特化した対物レンズも用意されている。

対物レンズの倍率

　有限補正系、無限補正系であるかを問わず、対物レンズには拡大倍率が記されている。しかし、レンズの拡大倍率はレンズの焦点距離とレンズから物体まで（とレンズから実像まで）の距離で定まるものであり、単体のレンズでは一般的には拡大倍率は一意的に定められないはずである。

　有限光学系の複式顕微鏡では対物レンズにより試料の像が接眼レンズの同焦位置に形成されたときに接眼レンズを通してピントのあった像が観察される。鏡筒長は一定なので、ピント調整は顕微鏡の鏡筒か試料ステージを動かして対物レンズと試料の距離を調整して行う。ピントがあった時点で対物レンズの試料側主点から試料までの距離と対物レンズの接眼側主点からピント面までの位置は対物レンズ毎に一意的に定まる。特に、ピント面までの距離は対物レンズによらずほぼ一定で鏡筒長に大体等しいので、対物レンズの焦点距離が定まるとシステムとしての拡大倍率も定まることになる。鏡筒長Ｌ、対物レンズの焦点距離ｆと拡大倍率Ｍとの間には、おおよそＭ≒Ｌ／ｆという関係がある。

　すべての有限光学系複式顕微鏡で機械的筒長が等しく接眼レンズの同焦距離も等しいなら、ある顕微鏡の対物レンズを他の顕微鏡に取り付けても、倍率に変動は生じないはずである。しかしながら、国による規格の違いや、さらには、メーカーの違い、メーカー内でもシステムの違いにより機械的筒長が異なるものが存在する。現存する国産の顕微鏡でよく用いられている鏡筒長には160mm、170mm、210mmの３種類が存在する。160mm、170mmは生物系の顕微鏡で使われる事が多く、これに対して210mmは落射照明が必要な金属顕微鏡で使われることが多い。

　ある筒長向けに設計された対物レンズを異なる筒長の顕微鏡に取り付けると２つの問題が発生する。１点目は、収差が増大することである。先の述べたように、対物レンズは特定の筒長で収差が最小になるように設計してあるため、それ以外の筒長の顕微鏡に装着すると性能が低下する。２点目は倍率が表示と異なってしまうことである。どの程度の差が生じるかを具体的に調べてみよう。焦点距離13.6mmの（後側主点の位置が対物レンズ取り付け面と一致する）対物レンズを160mmの機械的筒長（対物レンズ像距離150mm）の顕微鏡に装着する。この時、対物レンズの物体側主面から物体までの距離は15mmとなるので、拡大倍率が10倍となる。このレンズを機械的筒長210mmの顕微鏡システムに取り付けると、対物レンズの後側主面から結像位置までの距離が200mmとなるので、対物レンズの物体側主面から物体までの距離は14.6mmとなる。よって、拡大倍率は約、13.7倍となる。実際の対物レンズでは後側主面の位置が取り付け面とは必ずしも一致していないので、上記の計算は厳密に成り立つものではないが、おおざっぱな傾向は正しく示しており、基準鏡筒長がaの対物レンズをbのシステムに取り付けると、倍率はb/a程度変化する。

　戦前の顕微鏡についている対物レンズを見ると、倍率の替わりに焦点距離が記されているものもある。この場合は鏡筒長の長さから倍率を自分で計算しなければならない。また、昔の顕微鏡には鏡筒長をある範囲で変えられるものがあった。これにより、倍率の微調整が可能であったし、また、カバーガラスの厚みの不均一により生じる収差を、鏡筒長の変化により逆方向の収差を発生させて低減するという技も使えたようである。

　無限系においては、対物レンズの倍率は、対物レンズの焦点距離と結像レンズの焦点距離の比率で定まる。例えば、結像レンズの焦点距離が180mmのシステムでは20倍の対物レンズの焦点距離は9mmになる。このレンズを結像レンズの焦点距離が200mmのシステムに転用すると、拡大率は200/9=22倍となる。参考までに主なメーカーの結像レンズの焦点距離を長い順に記すと、200mm（ニコン・ミツトヨ・ライカ）、180mm（オリンパス）、164.5mm（ツァイス）となっている。

開口数と分解能

　対物レンズの性能として倍率より重要なのが開口数(NA)である。NAは
NA=nsinθ
と定義される。（定義によってはθを両側の角度としてNA＝nsin（θ/2)としている。）ここで、θは対物レンズの先端のレンズの最外周部から物体を見込む角度で、n は対物レンズと物体の間の媒質の屈折率である。

媒質が空気ならnは1なので、NAは最大で１以下の値となる。一般にNAは 4倍程度の対物レンズで0.1、100倍の対物レンズで 0.9程度である。NAが大きいほど対物レンズの分解能は高くなる。写真レンズにおいてはレンズの明るさを表すのにＦ値が用いられる。レンズの口径をＤ焦点距離をｆとするとＦ＝ｆ／Ｄである。NAが片側の見込み角で定義されているのに対して、Ｆはレンズの直径を用いて定義されているため、両者の間にはＮＡ＝１／（２Ｆ）（球面収差に対する補正がきちんなされている場合）という関係がある。この関係式から分かるもう一つのことは、同じ倍率ならNAの高いレンズほど明るいということである。螢光観測用の対物レンズの中には、拡大倍率から要求される以上のNA値のものがあるが、これは、NAを大きくすることにより明るくして微弱な螢光も観察できるようにするためである。

回折格子の観察

　アッベは回折格子の観察を通してNAと分解能の関係を明らかにした。回折格子ではなく、一般的な２点間の分解に関する定式化はレーリーにより行われた。両方の扱いにより係数はことなるが、何れにしても分解能は開口数に比例し観察波長に反比例する。ここでは、直感的に理解しやすいアッベの取り扱いに従って分解能と開口数の関係を考察する。アッベは、対物レンズ後焦点面の像にマスクをかけ、それにより物体の像がどの様に変化するのかを確かめた。しかし、後焦点面にマスクをかけるのは、実際の顕微鏡では行いにくいので、今回はNAを変化できるレンズを用いての実験を行った。

上の図がNAを変化できるレンズで、鏡筒に絞りが組み込まれておりこれによりNAが可変となっている。このレンズは元々は偏光顕微鏡のユニバーサルステージ用のもので、ユニバーサルステージを用いた観察では試料を斜めから観察することもあり、その時にピントのあう範囲を広くするために、絞りがついているものである。

　観察する対象は透過型のクロスタイプの回折格子である。以下に同じ場所を異なるNAで撮影した３種類の写真と、その時の対物レンズ後焦点面の画像を示す。

写真は左から総体的に高NA状態、中間NA状態、低NA状態である。高NA状態では回折格子のパターンがはっきりと見えている。そして、対物レンズ後焦点面では回折格子によって照明光が解説したスポットが見えている。中央部の白色部分が０次光で、上下、左右のスポットが、（±１，０）と（０，±１）次の回折、斜め方向が（±１，±１）の回折である。１次の回折スポットは露出が多くて中央部が白くなっているものもあるが、中央に近い部分が青で、遠い部分が赤になっている。これは、青い光より赤い光の方が回折角が大きいためである。１次の回折に外側にはうっすらと２次の回折の青から緑の部分が見えている。中間NA状態では０次の他には（±１，０）と（０，±１）次の回折しか見えていない。物体像を見ると高NA状態に比べてコントラストが弱くなっている。さらに低NA状態では０次の回折しかなく、また、格子はまったく見えていない。この一連の写真は、顕微鏡で回折格子格子として観察するためには、対物レンズに少なくとも１次の回折光が入射していなければならないことを示している。格子の間隔がｄの回折格子の回折角は、
dsinθ＝mλ
なので、最低次の回折の条件としてm=1を代入すれば回折角は
sinθ＝λ/d
である。回折された光が対物レンズの見込角におさまればいいわけだから、縞構造が観察されるための条件は
NA≧λ/d
あるいは、
d≧λ/NA
となる。NAが大きい程より細い縞構造が見られることを示している。上式を適用すれば、NAが0.5の対物レンズで、500nmの光を用いれば、１μｍ以上の周期の縞構造ならちゃんと観察できるはずである。空気中で用いる対物レンズでは空気の屈折率が１で、三角関数の最大値も１なので、NAも１は越えられない。しかし、対物レンズと物質の間を適当な屈折率の物体で充填すればNAは1より大きくなる。対物レンズの先端と試料の間を屈折率 1.5程度の油で浸漬する油浸レンズではNAが 1.4程度のものがあり、より高い分解能が得られる。最近ではより屈折率の高い固体を直接試料につけて、さらに高い分解能を実現するような手法も出現している。

観察波長の影響

　上の分解能の式は、観察波長が短いほど分解能が高くなることも示している。これは、上にも記したように、短波長の光ほど回折角が小さくなり、NAが同じなら、より短い周期に対応する回折光まで対物レンズに取り込めるからである。上の中間NA状態の回折像をよく見ると、緑色程度までの１次の回折光が入っていることが分かる。そこで、NAはそのままにして、照明光に青色のバンドパスフィルターを入れた観察と赤色のロングパスフィルターを入れた観察を行った。青色のバンドパスを入れた場合には、格子のコントラストが向上している（と思う）。これは、コントラストを低下させる原因になっている赤色の光をカットしているためである。

図：青色のバンドパスフィルターを通した画像。１次の青色の回折がはっきりと見え、物体像でも格子がはっきりと見えている。

図：赤のロングパスフィルターを通した画像。回折光はなく、格子像も見えていない。

　一方、赤色のフィルターをかけた方では回折光がほとんど入っておらず、それに対応して格子像も見えなくなっている。
　短波長光を使って分解能を上げるときには、バンドパスフィルターを用いて、のぞみの波長の光のみを用いて、コントラストを下げる長波長の光を遮断するようにした方がよいであろう。

照明条件による分解能変化

　分解能に関する上記の考察では試料に垂直にほぼ平行な光（低NA照明光）が照明されている場合を扱っているが、対物レンズの見込角と同じ角度で斜から照明光が入射すれば、垂直入射では１次の回折光を拾えないような条件でも、レンズの反対側の端で１次の回折光の片側の成分を拾うことができる。

上の写真は対物レンズのNAは低NA状態のままで、照明側の光軸をずらしたものである（コンデンサを動かしたか、コンデンサの絞り面に軸を外して穴を取り付けたかは忘れた…）。左側の回折像で白く大きいものが０次光で右側に見える青い輪郭が（１，０）次回折光である。右がこの状態の物体像で、１次の回折光が拾えた方向に関しては縞構造が見えているが、それと垂直な方向の縞構造は欠落している。

　ここまでの観察では照明はほぼ平行な光線（低NAの照明光）を用いていた。しかし、照明側も円錐状に入射する光を用いれば、上に示したような斜めからの入射光が360度全体に入ってくることになり、一方向だけでなく、全体に分解能が高くなるはずである。これは照明光学系のNAを高くすることにより実現できる。実際に、対物側のNAはそのままにして照明側のNAを大きくしたのが次の写真である。

図：照明側のＮＡを少し大きくした。中央の０次のスポットが大きくなり、周辺部に青の１次が見え始めている。これに対応して物体像の方も、コントラストが悪い物の格子が見え始めている。

図：さらに照明のＮＡを大きくした。０次光が対物レンズの全域を覆ってしまい１次の回折光が見えなくなっているが、原理的には１次の光がさらに含まれているはずである。実際、物体像のコントラストもさらにあがっている。　

　写真を見れば分かるように、照明側のＮＡを上げることにより分解能が上昇している。対物レンズの見込み角一杯の斜めの光で物体が照射された場合の１次の回折角は
2NAd=λ
なので、これより、１次回折光の一方が対物レンズに入る条件は
d≧λ/2NA
である。先ほどの場合にくらべて、分解能が２倍になることが分かる。

レーリーの分解能の式

　アッベの分解能の式は、直感的に納得しやすいものであるが、一方で回折格子の観察という一般的ではない観察対象を基にした議論となっている。より一般的な観察対象である２つの点の区別という議論がレーリーによってなされている。レーリーの扱いは数学的なものであるが、ここでは、式を追わずに物理的な背景の説明を行う。

　空間的にある距離離れた２つの点はフーリエ変換によりある空間周波数分布を持った三角関数の和として記述できる。ここの空間周波数の三角関数は回折格子であると考えることができる。そして、それぞれの回折格子が観察できるかどうかはアッベの議論に従って決定できる。アッベの議論では回折格子の間隔は１つであった。このため、回折光が対物レンズに入射するか否かにより、回折格子が観察されるかされないかの不連続な変化が生じた。しかし、２つの点の画像は多くの回折格子の画像の和となっている。このため、２点の間隔ｄが狭くなっていくと、空間周波数の高い成分から、回折角が大きくなって対物レンズに入射しなくなっていく。これは、物体像のコントラストの低下を招いていく。最初ははっきりと２点が区別できたのが、だんだんと２つの点の間のコントラストが弱くなり、最終的に２点の識別ができなくなるのである。では、どこまでコントラストが落ちると２点の区別が付かなくなるかというと、これは物理の問題ではなく生理学の問題となる。レーリーの扱いでは、１つの点の回折像の極小ともう一つの点の中心が一致した時を解像の限界とおいている。この場合の分解能の式は
d=0.61λ/NA
となる（はずだと思う）。

分解能以下の物体の観察

　顕微鏡の分解能の式が、周期的な構造や２つの点が見分けられるかで計算されていることには注意する必要がある。特に２点の分離に関しては、どの距離で解像限界とするのかには、最終的には物理的な根拠というよりも生理学的な根拠（目が、どの程度のコントラスト差まで識別できるか）によって定まっている。それ故に、検出系にCCDカメラなどを用いることによりS/N比を高くして微小なコントラスト差を強調して捉えることを行えば、古典的に考えられていた解像限界よりも小さな物を光学顕微鏡により識別することができる。これがビデオ顕微鏡技術の基礎となっている考え方である。

　また、物体の形が分からなくてよいのなら、分解能以下のサイズの粒子を識別することができる。これは暗視野の限外顕微鏡と呼ばれている古典的な手法である。この手法の起源ははるか紀元前に遡る。なにしろ、私たちが恒星を見ることができるのは、まさに限外顕微鏡で分解能以下の微粒子を観察できるのと同様の減少なのであるから。

作動距離（作業距離）

　作動距離(WD)は対物レンズの前面から、ピントがあう位置までの距離である。通常の高倍率対物レンズは作動距離は1 mm程度以下しかない。しかし、ホットステージを用いる観察においては、ホットステージの仕様上、対物レンズの先端から試料面までは10mm程度は必要となる。このため、通常の対物レンズは使用できない。ホットステージ中の試料を観察するには作動距離の長い対物レンズを用意する必要がある。

　かつては、ホットステージ中に保持した液晶試料観察にに使える、そこそこの倍率の対物レンズには、ニコンのユニバーサル回転ステージ用か、ユニオンの高温顕微鏡用しかなかった。ユニオンのレンズは巨大で、顕微鏡に取り付けるのには顕微鏡の改造が必要であった。ニコンのレンズは通常の対物レンズ並みのサイズであるが、ユニバーサル回転ステージ部分の補助レンズと組合わせて使うもので、対物レンズ本体の表記は20倍だが単体では 160mm鏡筒で13倍しかなくて倍率の混乱を引き起こすことがあった。

　最近は、光ディスクや光磁気ディスクデバイスの検査用などに作動距離の長い対物レンズが売出されており、これらのレンズを用いればホットステージの中の液晶セルも観察できる。ニコンの40倍の超長作動距離対物レンズは10mmの作動距離を誇っている。焦点距離は 5.1mm程度のはずなので、作動距離の方が２倍程度長いことになる。このようなレンズが実現できるのは、レンズの組合わせにより主点の位置がレンズの外側にもできるためである。しかし、レンズの構成は通常の対物レンズよりも複雑でその結果として価格も高価になる。

　メーカーによっては長作動距離の対物レンズが２段階あり、そこそこの作動距離でNAが大きめのものと、より作動距離は長いがNAが小さめのものが用意されていることがある。どちらを選ぶかは用途と必要とされる分解能により決定することになるが、ホットステージのガラスを通しての観察などでは対物レンズの指定条件からはずれており収差によりNA値から期待されるほどの分解能は得られないので、より扱いやすい作動距離が長いものを選択するのがよいであろう。

同高焦準（同焦点距離）

　通常の顕微鏡システムでは顕微鏡の取り付け面から合焦面までの距離が対物レンズによらずに同じになるように作られている。このような状態を同高焦準があっているという。このため、レボルバーに複数のレンズを装着している場合に、一つのレンズでピント調整を行いレボルバーを回転して対物レンズを切り替えてもピントはほぼあっているので、いちいちピント位置を探す必要はない。ただし、作動距離が短い高倍率の対物レンズでは、他のレンズに比べて1mmほど合焦面までの距離を短くしている場合がある。これは、レンズ切り替えのためにレボルバーを回すときにレンズ前面が試料に当たるのを防ぐためである。古来よりの顕微鏡の規格（ＲＭＳ規格）では同高焦準は45mmになっている。同高焦準を合わせるために、対物レンズの鏡筒長は倍率により異なっている。このため、対物レンズの後側主面より結像位置までの実質的な光学的鏡筒長は対物レンズにより異なる。それ故に有限補正系において、同じ倍率の対物レンズでも焦点距離が微妙に異なることがある。

　無限補正光学系で結像レンズの焦点距離が180mmの場合、２倍、５倍、１０倍、１００倍の対物レンズの焦点距離は、それぞれ90mm、36mm、18mm、1.8mmとなる（有限系でもこれに近い値になる）。無限補正光学系では、対物レンズを透過後に光束は平行になるので、対物レンズの物体側主面から物体までの距離は焦点距離と等しくなる。同高焦準が45mmの場合、５倍以上の対物レンズでは、主面の位置は取り付け面より物体側になるが、２倍の対物レンズにおいては、顕微鏡鏡筒に食い込むことになる。もちろん、対物レンズが鏡筒内に食い込むことは不可能なので、低倍率の対物レンズは前面に凹レンズを入れるなどの高度な設計技術により同高焦準を保っている。

　有限補正系においては、光学的鏡筒長が長くなるほど、無限補正系においては結像レンズの焦点距離が長くなれば長くなるほど、同じ倍率の対物レンズの焦点距離が長くなるので、低倍率の対物レンズで短い同高焦準を保つのは難しくなる。このため、結像レンズの焦点距離が200mmのNikonとミツトヨではそれぞれ60　mm、95　mmの同高焦準システムとしている。

　有限光学系で鏡筒長が異なる対物レンズを組み合わせると同高焦準が揃わなくなる。また、レンズのシリーズにより同高焦準が異なっていたり、低倍率のレンズのみ長くなっている場合があるので、レンズを組み合わせる場合には注意が必要である。同高焦準が揃っていないと対物レンズを変える度にピント合わせを行う必要が生じるし、レボルバーを回転する時に対物レンズの前面を試料にぶつけないように注意する必要がある。もっとも、ホットステージとの組み合わせで観察を行う場合には同高焦準が取れていてもレボルバーの回転時にホットステージの縁と対物レンズがぶつかることがあるので注意が必要である。

取り付けネジマウント規格

顕微鏡の取り付けネジの標準はRMS（Royal Microscopical Society）規格であり、そのサイズは

口径　　　　　20.32 mm　
ネジピッチ　　0.706mm（36山／1インチ）　
同焦距離　　45mm

となっている。古典的な顕微鏡のほとんどすべてはこの規格に従っており、異なるメーカー間で互換性がある（ただし、鏡筒長等の互換性は必ずしもないので、異なるシステムの対物レンズを取り付けると、画像の質が劣化したり、同焦点距離が狂ったりする）。しかし、落射暗視野照明用の対物レンズではRMS規格の20.32という口径では対物レンズ外周部の暗視野照明用の光路を確保できないので、より大きな口径の対物レンズが用いられていた。こちらについては標準的な規格がないので、メーカーによりネジ径が異なっており互換性がない。

カバーグラス厚さと球面収差

　対物レンズは試料との間にどの程度の厚さのカバーガラスを入れるか（あるいは、まったくカバーガラスを用いないか）を考慮して設計されている。これは、試料との間に屈折率の異なる層があると、光線の方向が変化し、１点で収束しなくなる（球面収差が発生する）からである。昔の顕微鏡の本を見ると、カバーガラスの厚さは重要視されており、0.17mm程度のカバーガラスの厚みが 10%違っても補正が必要であるとされている。カバーガラスの厚みには個体差があるために、厚みを測定するための器具も存在していた。

図：カバーガラスの厚み測定器。ツアイス社の戦前のカタログより

　工業顕微鏡カタログに掲載されている超長作動距離対物レンズは主に金属顕微鏡用であるが故にカバーガラス厚が 0mm（カバーガラスをつけない）設計になっている。しかし、液晶のセルの観察は時には厚み 1mm程度のセルのガラス板と、ホットステージの 1mm程度のガラス板を通して行なわれる。対物レンズの球面収差が補正してあっても、ガラスを通す光路がずれて球面収差が発生する。このため指定された条件以外での対物レンズの使用は画像のコントラスト低下と分解能の低下を引き起こす。はずである…。しかし、液晶業界においては、カバーグラスの併用による像の劣化が問題にはされていない。これは観察対象のコントラストが強いことと、さほど微細な構造の観察が要求されていないことによると考えられる。ただし、このことは対物レンズの性能を発揮させた観察が必要ないことを意味していないことには注意しておいた方がよい。なお、液晶観察用対物レンズ（作動距離が長く、ガラスの厚さの補正機構がついている）も販売されている。金額は同程度の作動距離の対物レンズに比べて倍程度で、なかなかには手を出しにくいものである。液晶基板の検査用顕微鏡用にほぼ標準で装備されていて数が出ているようである。ただし、必要だから装備されているというよりは、予めクレームを防ぐために装備しているという面もあるようで、現場で本当に最適化されて使われているのかには疑問が残るところである。

　球面収差のない状態では、光束は１点で収束し、この点の前後で広がり方は対称であるため、適当なピンホールを観察してピントを上下すると同じように像がぼける。しかし、球面収差があると、光束の収束が上下方向に非対称になるため、ピンホールを観察してピントを上下すると方向によりぼけかたが異なる。その観察によりある程度の球面収差の存在は確認できる（らしい）。ピンホールとしては、金属蒸着膜に生じたピンホールを用いることもあるようである。本当のピンホールほどにコントラストはあがらないが、適当な金箔をスライドガラスに張り付けた物の適当な穴も同様に用いることができる（と思う）。

無限系における結像レンズ焦点距離の対物レンズに対する影響

　無限系における結像レンズの焦点距離は対物レンズの設計に影響を及ぼす。例えば２０倍の対物レンズの焦点距離は結像レンズの１／２０になるから、10mm（結像レンズ200mm)、9mm（結像レンズ180mm)、8.225mm（結像レンズ164.5mm)となる（以下常にこの順番で記述することにする）。この対物レンズの焦点距離の違いが何をもたらすかを少しばかり検討してみよう（ここの記述は米ニコンのサイトに従っている。）。

　検討の第１項目は中心からずれた像の光路である。２０倍の顕微鏡では観察領域は約1mmの円内となる。この片端（中心から0.5mm）からの光線がどのような経路をたどるかを考えてみよう。無限系では試料位置は対物レンズの焦点面となる。従って、中心から0.5mm離れたところからの光束がレンズ通過後の正弦値は0.5/焦点距離となる。つまり、焦点距離が短いほど光束の傾きは大きくなる。このことと、上述した結像レンズによる対物レンズの焦点距離の違いを合わせて考えると、結像レンズが短いほど、対物レンズ通過後の光束の傾きが強くなることになる。対物レンズの後主面から10cmの距離における光束の広がりを計算してみると、結像レンズ200,180,164.5mmに対して5、5.6、 6.1mmとなる。この結果は鏡筒長を同じにした場合には結像レンズの焦点距離が短いほど結像レンズの口径を大きくしなければならないことを意味している。口径が大きく焦点距離が短ければレンズとしては明るくなるわけで、より暗いレンズと比較してレンズの構成が同じ場合には収差がどうしても増えることになる。こうしてみると、光学的には結像レンズの焦点距離があまり短くない方が光学系の設計が楽になることが分かる。ただし、結像レンズの焦点距離を無闇に長くしてしまうと鏡筒が長くなったり、対物レンズが大きくなるという弊害が生じる。

　無限系において同じ倍率のレンズなら、結像レンズの焦点距離が長いほど対物レンズの焦点距離も長くなるわけだが、このことは対物レンズの設計にいくつかの影響を与える。一点目は作動距離に関することである。焦点距離の長いレンズの方が作動距離を長くしやすい。それ故に、結像レンズの焦点距離が長いシステムの方が、長作動距離の対物レンズを設計しやすくなる。２つ目は同焦点距離の問題である。低倍率の５倍のレンズを考えてみると、結像レンズが200mmの場合には対物レンズの焦点距離は40mmとなる。同焦点距離が45mmのRMS規格だと素直に設計したレンズではレンズの前主面から物体までの距離が40mmとなってしまい、対物レンズの長さは5mm程度以下に抑えなければならなくなる。それを防ぐにはかなり凝った対物レンズの設計にしなければならなくなる。このような状況を防ぐために、ニコンの新しいシステムでは同焦点距離を60mmにミツトヨでは95mmにしている。レンズの互換性という点からは有り難くない影響である。そして、３つ目の影響は対物レンズの取り付けネジサイズである。対物レンズの後側の出射光束の直径Dは対物レンズの焦点距離とNAで定まっており、NAがそれほど大きくなければD=2NA×焦点距離となる。ニコンの生物顕微鏡用には４倍でNAが0.2の対物レンズがある。このレンズの焦点距離は50mmなので出射光束系は20mmとなる。RMS規格のネジ系は20.32mmしかなく、出射光束に対して負けてしまう。そこでニコンではRMSより大きなネジ径を採用している。４倍の対物レンズに対するNAの0.2という値は分解能のみを考慮すれば大きすぎる値である。しかし、同じ倍率の対物レンズではNAが大きい方が集光力が高く明るいので、このレンズは螢光顕微鏡と組み合わせて用いるためのものであると想像される。オリンパスの場合には、通常のRMSネジ径を標準で用いる代わりに、螢光顕微鏡用に特別に大きなネジを用いた高NAの低倍率レンズを用意している。

対物レンズメモ

　顕微鏡の対物レンズは大きく、生物顕微鏡用と金属顕微鏡用に分類される。生物顕微鏡は基本的にはカバーガラスがあることを前提に設計されている。また、高分解能を実現するための油浸仕様のものや、生きている生物系を直接観察するなどのための水浸使用のレンズなどもある。これに対して金属用は基本的にむき出しの表面観察用であり、上にガラスを被せないのが標準である。また、多くの金属試料は光を透過しないために落射照明となるので金属用の対物レンズは落射照明用の光の反射が視野に戻らないように考えた設計をしている。

　落射照明を行う金属用のレンズには明視野照明専用のレンズと明・暗視野照明両用のレンズがある。明視野専用レンズは通常の対物レンズである。これに対して落射暗視野照明もできる対物レンズではレンズの鏡筒の外側が２重になっていて、周囲のドーナッツ状の空洞を通して落射照明光を落とせるようになっている。このため明・暗視野用レンズの取り付けネジは古来よりＲＭＳよりも大きくなっている。ただし、メーカーによりネジ形状は異なっているものもあり、RMSのような互換性はない。

　液晶用以外にも生物顕微鏡用を中心に補正環付きの対物レンズがある。下図に示したのはツアイス社の戦前のカタログに掲載されていたものである。リングを回すと前２群と後２群の間の間隔が変化し、それにより球面収差の補正量が変化する（のだと思う。）。写真撮影用レンズでも球面収差の補正量が可変のものがある。ただし、こちらは、むしろ球面収差を積極的に与えて、柔らかな描写を行うためのものであり、顕微鏡対物レンズとはまったく正反対の理由により球面収差量の調整機構がついている。

図：補正環つき対物レンズ（戦前のツアイス社のカタログより）

　偏光顕微鏡用には特別の対物レンズが用意されている。これらのレンズは普通のレンズに比べて用いているガラスの歪が少なく対物レンズによる偏光の乱れが少なくなっている。しかし、不幸にして作動距離が短いものしかない。このため液晶観察などのホットステージを用いる観察にはこれらの対物レンズは使用できない。ホットステージの中の試料を観察できる超長作動距離の対物レンズは偏光に対する性質が偏光顕微鏡用に比較すれば劣るが、液晶のように複屈折が大きい試料では実用上は問題がない。作動距離さえ問題なければ金属用でも生物用でもかまわないが、現時点では金属用の対物レンズの方が作動距離の長いものがあり、ガラスによる球面収差を無視すれば使いやすい。

　偏光顕微鏡用の特殊レンズのひとつとしてユニバーサルステージ用の対物レンズがあった。これは、岩石などの薄片試料を任意の方向から観察するためのステージで、半球状のレンズと組み合わせて使うレンズ系で焦点深度を深くするために絞り羽根が付いているものもあった。ユニバーサルステージ用のレンズは作動距離が長いのでホットステージと組み合わせ用としても重宝するものである。かつてはレンズ単体のみで販売していたのだが、現在はステージとの組み合わせのみの販売となっており、実質的に選択肢からはずれることになってしまった。

　通常の対物レンズはもちろんのこと、偏光顕微鏡用対物レンズにしてもレンズによる偏光の乱れが発生する。乱れの原因は上述したガラスの歪みの他にレンズ面に対して光線が斜めに入射することが挙げられる。Ｐ偏光とＳ偏光では反射率が異なるので、ガラス面に光が斜入射すると透過成分の偏光は入射前と異なってしまう。反射率の違いは入射角度が大きいほど顕著になるので高NAの高倍率の対物レンズほど偏光の乱れが大きくなる。斜入射による偏光の乱れを見るには、高倍率の対物レンズを偏光顕微鏡に装着してクロスニコル下で試料をいれない状態でベルトランレンズを挿入すればよい。低NAの中央部は偏光による反射率の差が少ないので、偏光の乱れはなく暗くなる。また、と偏光子の軸に平行／垂直な方向も斜入射する光がＰ成分かＳ成分しか持たないので、反射による偏光の乱れがなく暗くなる。従って全体としては偏光子の軸に平行／垂直方向に暗い十字が走り、それに対して45度方向は僅かに明るくなる。その明るくなる程度が偏光の乱れを示している。

　液晶観察では偏光の乱れは実質的に問題にならないと記したが、しかし、水面上の単分子膜やフリースタンディング膜などの複屈折が小さな試料を観察する場合には対物レンズによる偏光の乱れがあると、コントラストの低下を招き、観察に支障が生じるようになる。斜入射による偏光の乱れは、コーティングによってある程度は減少できるものの、対物レンズが高倍率になれば避けられないものである。かつては、これを補正するためにレクティファイヤーを組み込んだシステムが考案され、ニコンからも市販されていたが、需要が少なかったためか現在では生産をとりやめている。レクティファイヤーは無限光学系システムを使えば自作も可能であろうが、現在の画像処理技術を考えると、CCDカメラと最大エントロピー法ソフトを組み合わせた差分処理の方が現実的かもしれない。

接眼レンズ

　対物レンズの像は接眼レンズによって拡大される。接眼レンズは、通常の虫眼鏡やルーペと同じ働きをしている。ところが、接眼レンズを取り外して、ルーペとして使おうとするとピントが合わない（ピントがあうものもあるが）。接眼レンズをはずして対物レンズの焦点位置を調べると、顕微鏡の鏡筒の端になっており、接眼レンズの内部に焦点面が位置する設計になっていることが分かる。接眼レンズは、対物レンズからの光を対物レンズ側の凸レンズ（視野レンズ）で集光して結像し、その像を目の側のレンズ（対眼レンズ）で拡大する。接眼レンズが単純なルーペになっていないのは、視野レンズで対物レンズからの光束を内側に曲げて画像をコンパクトに結像しないと、その後の拡大レンズの視野が広くはないために観察できる領域が小さくなってしまうからである。対物レンズの像が焦点を結ぶ面には顕微鏡の視野を区切るためのマスクがおかれている。このマスクの実効的な大きさをミリ単位で表記したものを視野数とよぶ。このマスクの内側の像は眼に到達して観察対象となる。視野数が20の接眼レンズと10倍の対物レンズを組合わせた場合、マスクの物体上での大きさは2mmであるので、2mmφの円内のものが観察される。視野数20の接眼レンズと40倍の対物レンズを組合わせれば、観察領域は 0.5mmφとなる。

　マスクの位置に物体をおけば、その像は対物レンズの像と重なってはっきりと観察できる。十字線や接眼レンズの目盛りは、マスクの位置に設置されている。分光測定などで、視野の一部分を切り出したいときは、マスクの位置にピンホールを置けばよい。
　対物レンズの像は視野レンズによって縮小されてマスクの場所に結像されるので、マスクの大きさは視野数の値よりも小さくなっている。当然、対眼レンズの拡大倍率は接眼レンズの表示倍率よりも大きくなっている。　

接眼レンズの一種に接眼微測計がある。これは、外部のマイクロメータにより移動する標識線を内蔵する接眼レンズで物体の大きさの計測に用いる。接眼微測計ではマスク位置が視野レンズと眼レンズの間にあるとスケールを移動するのが困難なため、マスクの位置が接眼レンズの外側にあるような光学系（ラムスデン接眼）を用いている場合がある。

図：ツアイス社戦前の接眼微測計（同社の戦前のカタログより）

　対眼レンズからの光はほぼ平行になって出射する。通常のルーペの観察では、物質からの光は全方向に広がっているので、どの位置に瞳をおいても物質の像を観察できる。しかし、顕微鏡の場合は、対物レンズからの物体の像は物体の場所によって特定の方向に進んでいるので、対眼レンズの外側では、ある１点で平行な光束が交わる以外は空間的に広がってしまう。この光束が交わる点をアイポイントといい、この位置に瞳をおけば全体の像が観察できるが、この位置からはずれると瞳の方向に来た部分の像しか観察できない。アイポイントが対眼レンズに近いとメガネをかけている場合には瞳をアイポイントまで近づけることが出来ず、メガネ使用者は全視野を一度に観察できない自体も生じる（単にメガネをとって観察すればよいだけだが）。また、操作性も悪い（まつげなどが観察のじゃまになる）ので、最近ではアイポイントが対眼レンズからある程度離れたハイアイポイントの接眼レンズが増えている。

有効倍率

目視の有効倍率

　顕微鏡の分解能に限界があるので、ある程度以上に画像を拡大してもより微小な構造が解析できるようになるわけではない。それどころか、倍率の増加にともない観察できる領域が狭くなるので観察効率が低下する。顕微鏡の有効倍率とは顕微鏡の分解能から期待される微細な構造が十分に観察される倍率のことを言う。

　視力が１の目は明視の距離で0.1mm程度離れた２点を識別できる。ただし、これはコントラストが強い場合で、コントラストが低い状態では識別能力は0.4mm程度まで低下する。上述したように顕微鏡の分解能は対物レンズの分解能で定まっており、対物レンズのNAと分解能の間にはｄ＝0.61λ/NAという関係がある。拡大倍率をMとすると、ｄM=400μｍとなれば分解能相当の画像が目でも分解できる。これより、400/M=0.61λ/NAであり、M=650NA／λとなる。λとして0.5μｍを入れれば、M=1300NAとなる。対物レンズのNAは乾燥系では１を越えることはなく、これより顕微鏡の最大倍率は1000倍程度に設定されている。有効拡大倍率以上に上げても情報量は減少するだけなので有効拡大倍率以上の拡大は無効拡大とか馬鹿拡大と呼ぶ。

　顕微鏡の対物レンズの中には理由があって上の有効拡大倍率の式からずれているものがある。その一つは半導体検査用の対物レンズで、これはNAから期待されるより高い拡大倍アイルを有しているものがある。これは、有効拡大倍率での観察は目の分解能限界であり疲労を招くので、目の疲れを押さえるためにあえて倍率を上げているものである。一方、５倍とか１０倍の低倍率の対物レンズのNA値は分解能から要求されるものより高くなっているのが普通である。例えば、５倍の対物レンズと１０倍の接眼レンズを組み合わせた場合の総合倍率は50倍なのでNA値は0.04程度あれば十分である。しかし、安価な対物レンズでもNAは０．１程度はあり、中にはNAが0.2もあるものもある。これは、倍率が同じならNAが大きいほどレンズが明るくなるためである。これらのレンズでは分解能の要請からではなく画像の明るさを確保するために必要以上に大きなNA値となっている。

顕微鏡写真の有効拡大倍率（銀塩写真）

顕微鏡写真においては、目視にくらべて考慮すべき要素が少し多くなる。一つは、フィルムへの記録の時にフィルムの解像度が対物レンズの拡大像に比べて余裕があるか、そして、もう一つはプリントした画像を観察するときに、目の分解能が印画に含まれる細かい構造を認識できるかである。

この後の議論で頻繁に使うことになる数値をここで導入しよう。それは対物レンズの拡大率と開口数の比R_M/NAである。R_M/NAは対物レンズにより作られた実像における、対物レンズの分解能に相当する間隔の距離に比例する数値である。インコヒーレント照明で観察波長が500nmという条件下でR_M/NA=100の場合、この距離は２５μｍとなる。倍率に比較してNA値が大きい（分解能が高い）ほど、R_M/NAは小さくなる。R_M/NAが小さな対物レンズほど、接眼レンズやトランスファーレンズの拡大率を高くしないと、対物レンズによっては結像されている細部の情報が失われることになる。液晶観察でよく用いられる、ノンカバーガラスの長作動距離対物レンズでR_M/NAは５０～１００程度の値となる。

フィルム面上での拡大倍率は対物レンズの倍率×トランスファーレンズの倍率となる（これは、業務用の顕微鏡で倍率の定まったトランスファーレンズを使う場合である。単眼の顕微鏡で通常の接眼レンズを用いて写真撮影を行う場合には、接眼レンズからフィルム面までの距離により異なる。）。トランスファーレンズとしては２倍から５倍程度が一般的である。通常の35mmレンズの対角線長は４３．３mmであり、普通の顕微鏡の視野数は２０～２６mm程度である。視野数が20mmの場合はトランスファーレンズの倍率が４３．３／２０＝2.17倍以上ないと、周辺部の画質が悪くなる。最近の対物レンズには視野数が２５～２６程度あるものがあり、これらの対物レンズなら２倍程度のトランスファーレンズでも35mmフィルム全域で良好な画像が得られる。メーカーにもよるが、35mmフィルム撮影用の一番低倍率のトランスファーレンズは２倍もしくは2.5倍となっている。

トランスファーレンズの倍率が低いほどフィルムに要求される解像度は高くなる。そこで、一番厳しい条件となる最低倍率の２倍のトランスファーレンズについて検討することにしよう。対物レンズの倍率がMの時に、フィルム面での撮影倍率は2Mとなる。対物レンズの開口数をNAとすると、分解能に相当する距離はフィルム面で2Mλ／２NA＝λR_M/NAとなる。ここで、λ＝500nmを用いると、距離はフィルム面で0.5^-3*R_M/NAmmである。これはR_M/NA=１００の対物レンズでは、0.05ミリとなり、1mmあたり２０本の縞模様に相当する。一方、通常のカラーフィルムはコントラスト比が低くても（1.6:1)、ミリ５０本程度の解像度があるので、２倍以上の余裕をもって記録できることになる。フィルムの解像度から来る限界を考えると、２倍のトランスファーレンズを使う場合に、R_M/NAが50程度以上なら、フィルムの解像度には余裕があることになる。通常は、この条件は満たされており、フィルムの解像度を気にすることなく撮影を行って大丈夫なことが分かる。つまり、フィルムの解像度からのみ考えると、２倍以上ならなるべく低倍率のトランスファーレンズを用いた方が、より広い範囲を一度に撮影でき、また画像情報の欠落もないので有利であることになる。

撮影されたフィルムには必要な情報が含まれているとして、それを印画にして観察するときに目の分解能が対応できるかを続けて調べてみよう。多くの場合、サービス判の引き伸しをみることになる。最近では大きめのサービス判もあるが、ここでは、古典的なL判（127×89mm）で考えてみよう。35mmフィルムからL判への拡大倍率は3.7倍程度である。フィルム面上での0.05ミリは印画上では0.185ミリになる。明視の距離での人間の目の識別能力は0.075ミリなので、これは、一応は分解できる値ではあるが、それはあくまでもコントラストがはっきりしている場合で、コントラストが弱い場合には、少しばかり厳しい値になっている。この時、２倍ではなく４倍のトランスファーレンズを用いれば、印画上のサイズは0.37ミリになり、余裕を持って観察できることになる。

ここでは、引き伸しが旧来の光学的なシステムにより行われるとして話をすすめた。しかし、最近のサービス判はデジタル出力装置の使用が普通になっている。そのため、上記の議論が必ずしも成立しない場合がある。例えば、300dpiの印画は、大凡、ミリ５本程度の解像度であり、デジタル処理時に画像情報の詳細が失われる危険性がある。

ポジフィルムで最終的にスライド映写を行う場合にも同様に観察条件から要求される画像サイズを元に考察を進めればよい。例えば、映写された画像を10m離れて見る場合に、画面上で分解能に相当する長さは３ミリ以上、コントラストを考えると１㎝程度以上でなければならない。R_M/NAが１００程度の対物レンズと２倍のトランスファーレンズの組み合わせの場合、フィルムを２００倍程度は拡大しなければならない。従ってスクリーンサイズは4.8×7.2ｍ必要である。これは、通常の講義室にあるスクリーンに比べると一辺が倍程度となっている。この考察より、ポジフィルムを使ってスクリーンに映写する場合には４倍以上のトランスファーレンズを用いた方がよいことが分かる。

テレビ画面による観察の場合の有効倍率

テレビ画面による観察の倍率Ｍは、対物レンズの倍率M_O、トランスファーレンズの倍率M_T、撮像素子とテレビ画面の大きさの比で定まるテレビ倍率ＴよりＭ_F＝M_O×M_T×Ｔで定まる。次に、撮像素子のサイズと、画面サイズから定まるテレビ倍率を示す。

	１０インチ（198×140）	１４インチ(270×211)	２１インチ(406×305)
１(12.7×9.5)	１６	２１	３２
２／３(8.8×6.6)	２３	３１	４６
１／２(6.4×4.8)	３１	４２	６３
１／３(4.8×3.6)	４１	５６	８５

通常のテレビの走査線は５２５本でインターレーススキャンの場合には縦方向の解像度は約３５０本である。横方向の解像度は信号系の周波数特性で定まっており（とはいえ、縦に比べて大きく離れた値にすることは現実的でないので）大体、３５０～７００本程度である。

　テレビ画像を観測する場合は（ホールなどで多数の人間に見せる場合は除いて）、画面の観察は最適な条件（すなわち、テレビ画面が目から離れすぎていて詳細が見分けられないことがないような状況）で行われていると仮定してよいだろう。この場合、対物レンズの性能を生かし切れるかどうかは、撮像素子のサイズとR_M/NAおよびM_Ｔの関係によって決定される。

CCDの画面サイズは公称サイズと必ずしも比例しないので、正確な定式化はできないが、１インチCCDのサイズを基準として、その他のサイズは公称サイズに比例すると近似する。また、ここでは縦方向の解像度に話を限ることにしよう（横方向はシステムの帯域によって変化するゆえ）。この時、CCD上でのテレビの解像度に対応する距離は0.05×CCDフォーマットmmとなる。一方R_M/NA＝１００の対物レンズで結像面の分解能相当距離が0.025mmなので、これより１／２インチ以下のCCDでないとR_M/NA＝１００クラスのレンズの性能を発揮できないことがわかる。この時の最終倍率は、１４インチディスプレイで観察するとして100×42=4200倍である。これが、テレビ画面で観察するタイプの顕微鏡の倍率が数千～１万倍程度に設定される理由である。

上記の倍率設定にすれば、対物レンズの性能を無駄にすることはない。しかし、その結果として観察できる領域が狭くなってしまう。１／２撮像素子の短辺の長さは4.8mmである。これと、35mmフィルムの短辺長24mmを比べると、その比は５であり、等倍映写のCCDで撮影される領域は５倍のトランスファーレンズをつけた35mmカメラで撮影される領域程度であることになる。35mmカメラでは５倍以下の2.5倍、２倍のトランスファーレンズも用意されており、上述の議論のようにそれらを用いても対物レンズの分解能を活かした撮影が可能である。つまり、35mmカメラの方が、CCDカメラよりも面積比にして４～５倍程度の領域を一度に撮影できるのである。

１／２CCDカメラ用に0.5倍程度のリレーレンズが用意されているシステムもある。このトランスファーレンズを用いると、35mmカメラによる撮影と同程度の領域を一度に観察できる。しかし、通常のテレビカメラシステムではシステムの解像度が対物レンズの解像度に及ばない状況となり、試料の細部を議論する場合には不適である。

ハイビジョンシステムは現行のテレビジョンシステムに比較して倍程度（面積比にすれば４倍）の分解能である。それ故、上記の0.5倍のトランスファーレンズをつけたCCDをハイビジョンシステムと組み合わせれば、分解能の劣化を引き起こすことなく、広い領域を同時に観察できる。

ＣＲＴを用いた観察の場合には、上記の議論とは別に、画素ピッチ由来の必要倍率も存在する。コンピュータ用のディスプレイは、ドットはミリあたり４本～５本程度である。従って、画面上の最低分解能は0.4～0.5mmとなる。分解能が１μmのレンズを用いている場合には、それ故に、最低でも400～500倍の倍率には拡大しないといけないはずである。この倍率制限は、通常はテレビの解像度から生じる制限よりは緩くはなる。しかし、モニター用画面が小さい場合には、こちらの制限が重要になることもある。

ここまでの議論では、テレビを前提にして話をすすめているが、コンピュータ等の画面表示でも基本的には同じような考え方で整理できる。とはいえ、コンピュータ画面上の解像度が高くても、撮影に用いたCCDの解像度がテレビ仕様の場合には、コンピュータ画面の解像度は無視して、上記のテレビ計算で話を進めなければならない。

焦点深度

－未完（というより始まっていない…）－

照明光学系

照明光学系の構成要素

　照明光学系は対物レンズや接眼レンズなどの観察側に比べて注意を払われることが少ない。しかし、きちんとした観察を行ない、明るさのむらのない写真を撮影するためには照明系の調節が重要である。顕微鏡の透過照明法には、大きく分けて

散光照明
クリティカル照明
ケーラー照明

がある。

　現在の標準的な顕微鏡では照明光学系は基本的には
光源→集光光学系→視野絞り→開口絞り→コンデンサレンズ→（試料）
という５つの要素を基本として、必要に応じてこれにリレーレンズやフィルター、拡散板を加えた構成になっている。このような複雑な構成になっているのはケラー照明を実現するためである。　

　３種類の照明のうち、散光照明は拡散した光で試料を照すもので、照明強度は弱く、照明のNAも小さい。しかし、広い領域を均一に照射できる。クリティカル照明は、光源の像を試料面に結ばせる照明方法で、照明強度は強くNAも大きくできる。しかし、光源の像が試料面にできるので照明むらが生じやすい。また、試料面に熱も収束するので熱によって試料に影響が出やすい。これらの照明の概念を図示する。

　ケラー照明は、大きなNAの均一で強い照明を可能にする方法であり、今日では標準的な照明方法である。ケラー照明（図参照）では、集光光学系を調節してコンデンサレンズの前の開口絞りの位置に光源の像を結像させる。開口絞りは試料側のコンデンサの光源側焦点の位置に置かれている（そのように設計してある）ので、結像した光はコンデンサレンズを通過した後は平行光線となる。コンデンサと試料面との距離は、視野絞りの像が試料面で結像するように調整する。こうすると、試料面では視野絞りの空中像ができるが、視野絞りの位置にはフィラメントなどのむらのある光源はなく、明るさがより均一であるので、試料面での明るさも均一になる。また、クリティカル照明に比べて光が部分的に集光することがないので、熱により局所的に加熱する危険性も減る。視野絞りの大きさを変えれば、試料面での照明領域を調整できるし、開口絞りを調整すれば、照明のNAを連続的に変えることができる。構造は複雑だが、それ以上の利点がある。

　光源には、全体の光強度よりは輝度が高いことが要求される。同じワット数の電球でも捲きが緩くて発光部分が広がっているものよりも、捲きが密で発光部分が小さなものの方が良い。かつては、映写機用の電球などが用いられていたが、今日では低圧ハロゲン球（12V点灯で50Wか100W）が主流で、さらに明るい照明が要求されるときにはショートアークキセノンランプやメタルハライドランプが用いられる。また、螢光顕微鏡では励起用に紫外光も必要なので超高圧水銀灯が用いられている。

　集光光学系を自作する場合には、照明光学系用のコンデンサレンズを購入する。少し高価になるが、収差の少ない非球面のコンデンサレンズも市販されている。あるいは、スライドプロジェクターの中古を購入して集光部分を調整して転用する方法もある。照明絞りには、市販の虹彩絞りが使える。自作の時には視野を明るくしようとして、つい大きめの光源を使ったり、ミラー付きのランプを用いたりしたくなるが、50W程度の低電圧ハロゲン球で充分で、下手にミラー付きのランプを使うと余計な光（迷光）が試料に到達してコントラストが低下することもある。市販の顕微鏡のランプハウスを見ると、発光部以外は黒く塗装されていて迷光が試料に到達しないようになっている。

　開口絞りと対物レンズは顕微鏡用に付属しているので普通はそれを用いる。しかし、ここで大きな落とし穴がある。通常の顕微鏡のコンデンサレンズは、試料がスライドガラスの上にのっていることを想定して設計されている。コンデンサレンズの作動距離は普通のもので 1mm程度しかない。メトラーなどのホットステージを用いると、散光照明しかできないのである。

　双眼の高価な顕微鏡では多くの場合標準でハネノケコンデンサが装着されている。このコンデンサレンズは、上のハネノケ部分をスイングしてはずせば長作動距離の低NAコンデンサとなる。上部をよけた状態で作動距離はホットステージとの組合せに十分な程度になる。しかし、NAは 0.2程度しかなく、高倍率の対物レンズには不十分である。一方、単眼の顕微鏡では単純なアッベのコンデンサがついていることが多い。アッベのコンデンサは標準で油浸でNAが1.2程度で作動距離が1mmしかないが、上玉をはずせば作動距離が10mm程度以上でNA 0.4程度のコンデンサとなる。この状態は作動距離も充分にある。ただし、コンデンサの位置は固定されているので、ケラー照明を行うためにはホットステージの位置を調整しなければならない。

　システム顕微鏡では対物レンズと同様に長作動距離コンデンサレンズがオプションとして用意されている。例えばニコンには作動距離10mmでNA0.65のコンデンサがある。ホットステージを用いる時には用意しておきたい品である。このコンデンサを用いても、メトラーのホットステージは試料までの距離が15mm近くあるので、完全なケラー照明は実現できない。それでも、ハネノケコンデンサを低NA状態で使うよりは実測で４倍程度は明るくなる。長作動距離コンデンサの上に適当な凹レンズを組合わせれば、メトラーのホットステージでもきちんとしたケラー照明が実現できるはずである。また、倒立顕微鏡には作動距離が長いコンデンサレンズがあるので、それを買ってきて組み合わせることも考えられる。

コントラストの付与

　多くの液晶分子は可視領域に吸収をもたない。液晶セル中を光が透過しても、配向分布により光の位相は空間分布を持つが光強度には空間分布が生じない。普通の顕微鏡は位相変化を可視化できないので、それを用いて液晶セルを観察しても多くは望めない。液晶観察には位相変化を可視化できる顕微鏡が必要である。その種の顕微鏡として干渉顕微鏡・位相差顕微鏡、偏光顕微鏡がある。

　顕微鏡は主に生物分野の研究のために発展した。観察対象は水溶液中の屈折率が水と同程度の淡色の物体であり、これらにコントラストをつけて可視化するために染色や干渉法・位相差法が発達した。干渉法や位相差法は比較的小さな位相の変化を捕らえるのに適している。一方、液晶試料は一般に大きな複屈折を持ち、セル中での位相差分布はかなり大きい。このため干渉顕微鏡や位相差顕微鏡よりも透過偏光顕微鏡がもっぱら用いられている。しかし、フリースタンディング膜のように複屈折が非常に小さい場合には、反射偏光観察や干渉顕微鏡（微分干渉顕微鏡）や位相差顕微鏡による観察が有用な手法となりうる。

　偏光顕微鏡は通常の顕微鏡の光学系に偏光子（光源側）と検光子（観察側）が加わったものである。偏光子を作るのに必要な偏光素子は1828(9?)年にニコルにより発明された。その素子を用いた偏光顕微鏡の発明については1834年にタルボットによるという説と1845年ごろにソーベイによるという説がある。ニコルの発明した偏光素子は方解石の偏光プリズム（ニコルプリズム）であった。現在の偏光顕微鏡ではほとんどの機種では偏光フィルムを偏光素子として用いている。しかし、最初に偏光顕微鏡に用いられていた偏光素子の影響は未だに残っていて、偏光子と検光子を直交させた状態を「クロスニコル（直交ニコル、あるいは十字ニコル）」（正確にはcrossed　nicols)と呼ぶ。

　クロスニコルにした偏光顕微鏡で液晶セルを観察すると、配向ベクトルの方向が偏光子と垂直／平行な領域では入射直線偏光は透過後も偏光状態に変化がなく、光は検光子で吸収されてしまい暗視野となる。それに対して垂直／平行からずれている領域では入射直線偏光の偏光状態が変わるために透過成分が出現して明るく見えるようになる。偏光顕微鏡は液晶の配向方向を可視化できる。
　偏光顕微鏡であれば、単眼のコンパクトなものであれ、双眼の見るからに高価なものであれ、液晶を観察する上で問題になるような性能の差はない。双眼顕微鏡のメリットは光源が内蔵されており安直に使用できることと、見た目がかっこ良く高級なことをやっているという気持ちになれることぐらいである。一方、単眼の顕微鏡は自由度が大きく、ちょっとした悪戯を試みる時に役にたつ。いずれの顕微鏡を使うにせよ、顕微鏡の原理を知らないことには性能をきちんと引き出すことはできない。顕微鏡を使いこなすには光学系についての最低限の知識が必要である。

その他の光学素子

　偏光顕微鏡には、対物・（結像）・接眼レンズからなる拡大光学系と照明光学系という普通の顕微鏡にも備わっている光学系に加えて、偏光顕微鏡に特有な光学素子として偏光素子・位相差板・ベルトラントレンズがついている。かつては、偏光素子の材料として方解石のプリズムが使われていた。しかし、方解石のプリズムは、加工に手間がかかることなどから高価で、現在ではフィルム偏光子が一般に用いられている。フィルム偏光子はポリビニルアルコールフィルムに沃素をドープして延伸したもので、商品としてはポラロイドやダイクロームなどがある。偏光素子の消光比が高い程偏光顕微鏡のコントラストも高くなる。フィルム偏光子とプリズム偏光子ではプリズム偏光子の方が消光比が１桁程度いいので、特に複屈折の小さな試料を検鏡するときには、ポラロイドフィルムではなく、方解石プリズムの偏光素子を用いた方がコントラストがよい。しかし、そのような場合には対物レンズやコンデンサレンズなどの光学系による偏光の乱れが問題になる。偏光顕微鏡は複雑なシステムであり、一部だけスペックを高くしても全体のバランスがとれていなければ良い結果は得られない。

　位相差板を挿入する部位は、対物レンズと検光子の間にある。ほとんどの偏光顕微鏡には鋭敏色板と1/4波長板（ナトリウムのＤ線に対する）が付属している。これらの意味と使用法は後のセッションで紹介する。

　位相差板には複屈折の値を連続的に変えられるものがある。例えばベレック型コンペンセータは複屈折のある板を回転することにより、ある範囲で連続して複屈折を変えられる。複屈折の値を簡単に見積もるには簡便で便利な道具である。

　ベルトラントレンズは通常の検鏡時には光路からはずされている。ベルトラントレンズを入れた状態での像はコノスコープ像と呼ばれる。コノスコープ観察については別項で紹介する。

顕微鏡のセットアップ

単眼式顕微鏡の光源とコンデンサのセットアップ

　光源が内蔵されていなので、別に用意する必要がある。メーカー製のケラー照明用装置もあるが、かなり高価であり、、また最近では新規に購入することは難しいかもしれない。一般には手頃な照明を用いることが多いと思う。ケラー照明を行なうつもりはなく、とりあえず見えればいいのなら、そのあたりの白熱電球がが手軽である。それで、照度が足りない場合には１００Ｖのハロゲン電球を用いればよい。

　ケラー照明を行なうなら、低電圧ハロゲンランプに適当な集光光学系を組合わせる。調光が必要な場合には、低電圧ライティングダクト用の調光器が比較的安価である。ただし、カラースライド撮影を主に行う場合にはランプの色温度の再現性を良くするように電圧のモニターがあった方がよい。ハロゲン球は輝度の高いものが好ましいので12V50W程度の巻きのコンパクトなハロゲンランプを用いる。コンデンサレンズ（光源側）を用いて、光源フィラメントの像を開口絞り位置に結像させる。顕微鏡の下部の反射鏡は片面が平面で反対側が凹面となっている。コンデンサレンズを用いる場合には必ず平面鏡を用いる。凹面鏡はよほど特殊な場合でなければ用いることはない。コンデンサはオリンパスのPOSなら上玉をはずし、ニコンの POHなら上部をはねのけて低NA状態にして用いる。

複眼式顕微鏡のセットアップ

　光源は内蔵されているものを用いる。光源電圧は、調整できるようになっているが、なるべく一定にする。最大値では電球の寿命が短くなるので、写真撮影でどうしても明るさが必要な時以外は避けるべきである。かつては、電球の輝度が低かったために、写真撮影などの時に電球に定格以上の電圧をかけて、寿命と引き換えに明るくする（超輝）技術があった。しかし、ハロゲン球が用いられるようになって光源の輝度が高くなったので、通常は写真撮影位置か、それ以下程度で充分に明るいはずである。もし、暗いようなら光学系の調整が悪いことを疑うべきである。ランプを交換した場合には、機種によってはランプの位置を調整する必要がある。機種のマニュアルをよく調べること。

　コンデンサレンズは、ホットステージを用いる場合には長作動距離のものを用いたい。オリンパスには、偏光用には長作動距離コンデンサがないので、金属顕微鏡用の長作動距離コンデンサに簡易偏光装置を組合わせればよい。長作動距離のコンデンサレンズが手元にない場合には上部をはねのけて低NA状態で用いる。

ケラー照明のセットアップ

　10倍程度の対物レンズにする。試料面（と同じ高さ）に物体をおき、そこにピントを合わせる。視野絞りをしぼって行くと、視野の外周部が暗くなっていく。照明されている部分の輪郭がはっきりするようにコンデンサ（コンデンサが動かせない場合には試料面）の位置を調整する。このとき、照明されている部分の中心が視野の中心からずれていたら、コンデンサの位置を調整して芯だしを行なう。　これで、原理的にケラー照明が実現できている。ただし、ホットステージの試料面までの距離がコンデンサの作動距離より長い場合にはきちんとしたケラー照明は出来ないので、なるべく暗部と明部の境界がはっきりするよう調整する。

　試料面での照明領域は対物レンズを通して観察できる領域より僅かに広い程度に調整する。それ以上の領域を照射しても、像の明るさは変化せず、迷光のみが増大し不利である。

対物レンズの芯だし

　偏光顕微鏡で試料を観察する時には、試料の光軸と偏光板の軸の角度によりコントラストが変化するので、観察目的に応じて試料を回転する必要がある。このため、普通の偏光顕微鏡には回転ステージが組込まれている。ステージの回転中心と対物レンズの光軸が一致していないと、ステージを回転すると観察される場所が移動し、はななだしい場合には視野外へ移動してしまう。このような状態では満足な観察ができないので、光軸の調整を行なわなければならない。具体的な方法は顕微鏡によって異なるが、対物レンズのマウント部分に位置の微調機構で調整する。

　回転中心を調整する場合には十字の入った接眼レンズを使用すると作業が楽になる。まず、像の中で適当な目印となる部分が十字線の中心に来るよう試料を動かす。次に、回転ステージを 180度回転する。この時に芯が出ていなければ目印の部分は円運動をして十字線の中心からはずれる。 180度回転した状態で目印が視野内にあれば、接眼レンズの十字線の一方が目印を横切るようにする、十字線を回転して調整する。その後、目印が回転後の位置と、十字線の中心との真中になるように調節を行なう。これで、芯だしは完了である。もし、調整に自信がない場合には、この操作を、 180度回転したあとも目印の位置が動かなくなるまで繰り返す。また、狂いが大きくて、 180度回転すると目印が視野外にいってしまう場合には、目印の動きから推定される回転中心が視野の中央に来るように粗調整を行ない、その後で上のステップを行なう。

　対物レンズの芯出しは、一度行なえば対物レンズを取り外してつけなおさない限りは（長期的なずれを除いて）必要がないはずの作業である。ただし、顕微鏡によっては目視用の接眼と写真撮影用の接眼で中心が一致していない。そのような鏡筒で目視用に対物レンズの芯だしを行なうと写真用鏡筒では芯があわない。両者の狂いがそれほど大きくないのなら、写真用の方が視野領域が狭く芯の狂いに弱いのでそちらを優先する。

顕微鏡の清掃・簡単な修理

　顕微鏡の光学素子に埃がついたり汚れたりすると、像に滲みが出たり画面上に黒い斑点が現れたりする。観察していて見え方が悪い場合には光学系の掃除を行なうべきである。

　対物レンズやコンデンサレンズ等の掃除には、まずブロアー（写真用のゴム球タイプで十分である。）で埃をはらい、その後にレンズクリーニング液とレンズクリーニングペーパーで汚れを拭う。これらはカメラ店で購入できる。それ以外で、注意しなければならないのが、接眼レンズのスケールグラスと照明光学系の光源よりの光学素子である。接眼レンズのスケールのゴミは、そのまま黒い斑点として観察される。もし、接眼レンズを回転して、一緒に動くゴミがあれば、それは接眼レンズのスケールグラス部分にある。接眼レンズの内部なので、一度分解して清掃する必要がある。照明光学系のゴミは、視野絞り付近にあるものはケラー照明の場合にはぼやけた斑点として画面に現れる。ケラー照明以外の条件になっている場合には、思わぬ部分のゴミが試料面でほぼ焦点を結び黒い斑点となることがある。コンデンサを動かしてボケ具合が変わる斑点は照明系のどこかの汚れである。

　それ以外にホットステージのガラス面の汚れなども問題になるので、注意しておく必要がある。特に液晶試料は、高温である程度蒸発してホットステージのガラスの内面に付着したりするので、内側のガラスの汚れに気をつける必要がある。　光学素子の中で、方解石でできているプリズムや、ガラスで挟んでいない偏光板、雲母や石膏などの柔らかい材質で出来ている波長板の掃除は注意深く行なう必要がある。僅かなことで傷がついたり表面が劣化して使い物にならなくなる。特にフィルム偏光子の清掃にアセトンなどの有機溶媒を用いると表面が溶けて使い物にならなくなる。また、その他の素子の清掃でも、レンズクリーニング液や有機溶媒をつけすぎるとまわりこんで悪さをすることがあるので注意しなければならない。古い顕微鏡の本にはキシロール（キシレン）がレンズ掃除用に推奨されている。しかし、最近の本にはキシレンを用いてはいけないという記述がある。書籍に頼りすぎることなく、メーカーのサービスセンターに問い合せるなどの努力をすべきである。いい対物レンズは 1本で10万円以上する。問い合せをするくらいの価値はある。

　なお、レーザー用のミラーのクリーニングにはアセトンとメタノールがよく用いられている。これはレーザー用のミラーが接合部分を持たず、また表面が誘電体多層膜で有機溶媒に侵されないことと、汚れの主原因が空気中のほこりや油、人体からの油脂分で有機溶媒に可溶なもののためである。対物レンズの汚れも液晶観察をおこなっている場合には有機物が主になるので、アセトンやメタノールは有効である。しかし、対物レンズにはレンズどうしの接着面があり、その接着剤は有機物に侵される可能性があるので、有機溶媒を多めに使って液がレンズの接合面に流れるとレンズを劣化させる危険性もある。なるべく溶媒は使わない方がよい。

　この他、偏光顕微鏡で使われていることはまずないが、回折格子や金属表面鏡などの表面が金属でコーティングされた光学素子は基本的に拭うことは出来ず、ゴミをブロアーで吹き飛ばす程度のことしかできない。　顕微鏡を自作の光源と組合わせていて集光用の凹面鏡を用いるなどのドジをふむと偏光子が損傷することがある。その場合には偏光子を交換することになる。メーカーに修理を依頼するのも一つの方法であるが、また損傷が予想される場合や、消光比に多少の問題があってもかまわない場合は、自分で適当な偏光板を取り付ける方が安上がりである。偏光板は、消光比のしっかりした商品を用いる。偏光板は１枚当りの透過強度と２枚重ねのときの消光比でランク分けされている。消光比は１枚当りの透過強度が低いものほど良くなるが、全体が暗くなる。ポラロイド社の製品なら HN38Sあたりが手頃ではないかと思う。フィルムは板状で売られているので、それを購入してフィルム面を傷つけないように注意しながら偏光子が入る場所のサイズに成型する。大雑把にはカッターナイフとニッパで形状をつくり、後はやすりで修正する。ガラス板で挟んだ円形の偏光板も売られているので、手元の顕微鏡の取付部分とサイズが一致する商品がある場合には、それを購入すれば楽である。偏光板には直線偏光板の他に円偏光板もある。それを使えば円偏光顕微鏡となる。使い道としては、可視領域に特性反射のある試料のらせんの巻き方を一瞬にして確認できることであろうか…。